土传病害是土壤中[1]病原物侵染寄主植物所引起的一类植物病害。一般农作物栽培3-4年后土传病原菌会越来越严重，对农产品品质、产量及生长造成影响。可使农产品产量下降20％-40％，情况严重的甚至绝收。近年来随着农业结构调整，设施农业发展迅速，温室大棚栽培面积已达约270万公顷。但由于大棚生产品种单一，复种指数高，再加上温室大棚高湿、高温的特殊环境和管理模式，随着栽培时间延长，土传植物病害发生严重，导致农产品产量下降，品质变差，严重制约了保护地栽培的可持续发展^[1]。特别是近年来，由于温室大棚及其相关设施日益完善，保护地栽培已经进入了稳定的规模化生产阶段，这更为植物土传病害在温室大棚的发生创造了适宜的生态环境和滋生条件^[2]。我们采用多点取样的方法，在同一地块温室大棚内和大棚外分别采取土壤样品，通过实验室培养、检测得出如下结果：棚内土壤中，土传病原菌数量是棚外3.2倍，其他微生物如细菌量减少了7.8倍，真菌量减少2倍，放线菌减少5倍，农药残留量却比棚外高了约6.7倍。可见温室大棚内土壤中病原菌大量孳生繁殖，导致其他有益微生物数量降低，严重破坏了土壤微生态平衡；另外，土传病原菌的大量存在，也易引发病害频繁发生，而农民频繁的喷药防治，又增加了土壤和蔬菜中的农药残留量，形成恶性循环。因此，降解土壤中的农药残留，抑制土传病原菌成为国内外学者研究的重点^[3-10]。

针对这一问题，本实验室分离、选育出能分解多菌灵等氨基甲酸酯类农药的降解菌T11和能有效抑制尖镰孢菌(Fasariumsp.)、灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）等土传病原菌的生防菌T41，通过混菌发酵制得土壤生物修复剂，该修复剂既能有效抑制土壤中的土传病原菌，提高有益微生物数量，修复被破坏的生态环境；又可生物降解土壤中的农药残留，使生产的农产品达到绿色食品标准。这就从根本上解决温室大棚产生的作物发病率越来越高，产品中的农药残留量越来越高，而农产品产量和品质却逐年下降的问题。

1  材料与方法

1.1实验材料

木霉（Trichoderma spp.）T11降解菌株：本实验室在农药厂仓库土壤中分离、选育得到；木霉T41为本实验室筛选出的高效生防菌株；

50%多菌灵可湿性粉剂,江苏靖江农药厂提供；

纤维素复合酶（NS50013），由诺维信北京公司提供；

 液体培养基：麸皮浸出液100mL, （NH₄）₂SO₄  0.2g-0.4g，K₂HPO₄  0.2g-0.3g，CaC0₃ 1 g，补加水至1000 mL，调pH6-6.5；

固体培养基：已预处理的秆粉 10g，葡萄糖0.7 g，（NH₄）₂SO₄  0.4g, KH₂PO₄  0.2g，MgS0₄·7H₂0 0.08g ，水30mL，调pH6-6.5；

PDA培养基：土豆200,葡萄糖20,琼脂18,水1000；

1.2、水热预处理

玉米秸秆原料自然风干后，通过物料粉碎机将风干的玉米秸秆粉碎、筛分，筛选出粒径约40目的部分备用。

取10g粉碎至40目玉米秸秆粉和200 mL去离子水，分别加入催化剂FeCl₃ 0.1、0.6、1.1、1.6g、2.1g，混合后加入到 500 mL 的反应釜中，并密封反应釜。检测不同催化剂加入量下的木质素溶出率。

1.2.1第一级预处理

打开磁力搅拌和冷却水阀门，搅拌器转速调至 250r/min，打开电加热装置开始加热。当温度到达160-170℃，恒温保持时间 20-22 min进行水解，分离玉米秸秆中的半纤维素。预处理反应结束后，通过布氏漏斗进行固液分离，固体相进行第二级水热预处理；液项返回一级预处理当做水继续使用。

1.2.2第二级预处理

一级处理后的固体10g及200mL 去离子水，加入到 500 mL 的反应釜中，并密封反应釜。当温度达到200℃时，恒温20-25 min，进一步脱除木质素，使秸秆结构变得疏松。二级水热预处理反应结束后，将物料通过布氏漏斗进行固液分离，清液作为二级预处理的拌料水循环回用，固项底物送至固体发酵装置。

1.3 种子液制备

将木霉T11、T41菌株接分别接种在PDA培养基上, 于25℃恒温培养5d,从菌落表面各挑取绿色分生孢子,放入装有100mL液体培养基的三角瓶中,于280r/min振荡30-35min,用血球计数板对孢子悬浮液计数,控制孢子浓度10⁸cfu/mL。

1.4 固体发酵

在250mL三角瓶中放入10g固体培养基，灭菌后以5%接种量接入1.3种子液，同时加入10FPU/g底物的纤维素复合酶，振荡混匀后于25℃发酵培养6d,取样干燥后用血球计数板测产孢量，当分生孢子量达到1.0×10¹⁰cfu/g时即可终止发酵，固体发酵物风干后即为生物修复剂。

1.5  修复剂在灭菌土壤中的降解效果

从农田取土样,去除石块等杂质，于150℃干热灭菌2h。将100mg多菌灵和5g生物修复剂放到150mL无菌水中混匀，再与1000g灭菌土混匀,使含水量达到15%，放入已高温灭菌的花盆内。将盆口用五层纱布包扎好，于25℃保湿、保温培养，定时取样测定多菌灵含量^[11]。另设100mg多菌灵、5g固体培养基和1000g灭菌土混合为对照处理,重复3次。

1.6  修复剂在自然土壤中降解效果

将多菌灵、修复剂和适量水混合，依照1.5方法，与折合1000g干土的自然土混匀，调节含水量达15％。另设加入等量固体培养基、多菌灵和自然土混合为对照,理重复3次。将盆土置于25℃保湿、保温培养，取样检测多菌灵含量。

1.7  修复剂对黄瓜枯萎病防治效果

试验设3个处理：A 取修复剂5g与2000g土壤混合后装入盆内；B 取2000g土壤装入盆内，用50%速克灵可湿性粉剂500倍液15ml灌根；C 取2000g土壤装入盆内作为对照。以上三盆分别移栽8株津青1号黄瓜苗。然后分别取15ml尖镰孢菌孢子悬浮液（10⁵cfu /ml）灌根。每处理4盆，重复3次。于25℃保湿15d，调查瓜苗发病情况，计算发病率和对枯萎病的防治效果。

发病率=感病株数/总株数×100％

防治效果=（对照发病率-用药发病率）/对照发病率×100％

2、结果与分析

2.1 热水预处理

玉米秸秆主要成分为纤维素、半纤维素和木质素等。其纤维素、半纤维素和木质素相互交织、形成致密的三维网状空间结构，从而导致秸秆中可发酵碳水化合物组分很难被微生物直接代谢利用。需要先预处理脱除半纤维素或木质素，破坏纤维素的结晶结构。但传统的酸、碱预处理过程，会产生大量的废水，面临着污染严重、设备腐蚀性大、处理成本高等问题。针对这一问题，我们开发了水热预处理工艺。高温液态水能够自电离产生H₃O⁺，离子积常数增大，介电常数降低，能够有效水解半纤维素，破坏木质纤维素致密结构，从而提高纤维素酶的可及度。水热预处理玉米秸秆，能有效水解玉米秸秆中的半纤维素，降解少量木质素，破坏纤维素的结晶结构，从而提高玉米秸秆中纤维素的利用率。