有关动物性食品中砷含量的检测已成为食品安全的研究热点之一[5]。目前检测砷方法受到样品前处理复杂、检测设备价格高、检测成本高、操作耗时、费力等限制，不利于对食品中砷污染含量的快速检测[6-7]。目前国内外已有铅、汞、铬、镉重金属ELISA检测方法的相关报道[8-11]，但尚未见砷元素的报道。为建立砷元素ELISA快速检测方法，本试验采用双功能螯合剂（ITCBE）螯合砷元素，再偶联至载体蛋白BSA或OVA上，合成并鉴定了砷元素的人工免疫抗原和人工鉴定抗原。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
砷元素标准溶液（1mg/mL），纯度≥99.0%，购于中国计量科学研究所；异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（Isotrhiocyanobenzyl-EDTA,ITCBE），购于上海东仁化学科技有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）、鸡卵清蛋白（ovalbumin,OVA）、透析袋（8000～14000），购于Biotopped 公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-Hydroxy- ethyl) -1 – piperazineethanesulfonic acid,Hepes）、PBS磷酸盐缓冲液，购于Solarbio公司；三乙胺、二甲基亚砜（DMSO）均购于天津市富宇精细化工有限公司，其它试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-2600紫外分光光度仪,日本岛津公司；核酸蛋白质测定仪，BioTek基因有限公司；高速冷冻离心机，美国Thermo公司；DYY-Ze聚丙烯酰胺凝胶电泳仪，北京市六一仪器厂；ZHWY-2102C全自动振荡培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司；HVE-50高压灭菌锅，HIRAYAMA公司。
1.3 方法
1.3.1 人工免疫抗原As3+-ITCBE-BSA的制备
采用异硫氰酯法[12]，合成人工免疫抗原As3+-ITCBE-BSA。操作如下，称取5.0 mg ITCBE 溶于0.5 mL DMSO二甲基亚砜中，形成10 mg/mL金属螯合剂溶液；取0.5 mL 10mg/mL金属螯合剂溶液逐滴入0.85 mL砷元素标准溶液，用三乙胺溶液调PH=7.0，置于25℃摇床24h，形成As3+-ITCBE溶液（As与ITCBE摩尔比1:1）。
称取BSA 20.0 mg溶于1mL Hepes缓冲液（10 mmol/L Hepes,pH8.0）中，形成载体蛋白溶液；取As3+-ITCBE溶液在均匀搅拌下逐滴到1 mL的BSA蛋白溶液中，随后用三乙胺调PH=9.0，25℃下摇床反应 24h，制成人工免疫抗原As3+-ITCBE-BSA溶液。上述溶液反应后装入处理好的透析袋中，用0.01mol/L、pH=7.4 PBS缓冲液透析至透析袋中透明，没有沉淀，透析过程中每天换液3次；5d后收集透析袋中液体，以0.5mL/管体积分装入EP管。
1.3.2 人工鉴定抗原As3+-ITCBE-OVA的制备
采用同上述1.3.1方法，用OVA蛋白代替BSA制备人工鉴定抗原As3+-ITCBE-OVA。
1.3.3 对照人工免疫抗原的制备
用去离子水代替重金属砷标准溶液，制备无金属抗原ITCBE-BSA，其他步骤同1.3.1。
1.3.4 对照人工鉴定抗原的制备
用去离子水代替重金属砷标准溶液，制备无金属抗原ITCBE-OVA，其他步骤同1.3.2。
1.4 抗原的鉴定
1.4.1 抗原浓度的测定
以PBS缓冲液作为空白对照，用蛋白核酸测定仪在280nm紫外波长下测As3+-ITCBE-BSA、As3+-ITCBE-OVA溶液的蛋白浓度，判断抗原是否偶联成功。
1.4.2 抗原及载体蛋白的紫外扫描分析(UV)
用0.02mol/L pH=7.4的PBS缓冲液为空白对照。将As3+-ITCBE-BSA、As3+-ITCBE-OVA、ITCBE-BSA、ITCBE-OVA分别用PBS缓冲液稀释50倍。同时适当稀释BSA和OVA溶液浓度。各取4 mL，在波长260nm～400nm范围内进行紫外扫描。
1.4.3 抗原中砷含量的检测
利用氢化物原子荧光光谱仪检测人工免疫抗原和人工鉴定抗原中砷的含量。
1.4.4 抗原SDS-PAGE电泳鉴定
用PBS缓冲液将As3+-ITCBE-BSA、As3+-ITCBE-OVA、ITCBE-BSA、ITCBE-OVA及BSA和OVA蛋白溶液稀释至0.15 mg/mL，再用SDS上样缓冲液处理样品，用5%浓缩胶，12%分离胶，上样量10μL/孔，浓缩胶电压为100V，分离胶电压为80V，进行垂直SDS-PAGE电泳约3h，加入考马斯亮蓝R-250染色液染色2h，再用脱色液脱色约24h，至蛋白带清晰可见为止，最后拍照保存。
2 结果
2.1 抗原蛋白浓度
利用核酸蛋白测定仪，在280nm紫外波长下测定As3+-ITCBE-BSA、As3+-ITCBE-OVA中蛋白浓度分别为4.692 mg/mL，5.726 mg/mL。
