八角金盘(Fatsia japonica (Thunb.) Decne. et Planch.)是一种优良的观赏植物也是药用植物,为五加科常绿灌木。八角金盘四季常青,叶片硕大,叶形优美,浓绿光亮,是深受欢迎的室内观赏植物。其叶、根、皮有药用价值。2012年我们在吉林省桦甸调查药用植物资源种类时,发现八角金盘发生了黑斑病。症状为被危害的叶片出现100-150mm圆形或不规则形的暗黑色病斑,病斑周围常有黄色晕圈,严重时导致叶片大面积枯死,经查该病害由交链孢属 (Alter nariasp .)引起[1],国内尚未报道。
1.材料与方法
1.1供试材料
八角金盘黑斑病病菌由吉林农业科技学院植物病理实验室提供;
试验仪病器:恒温培养箱、无菌操作台、高压灭菌锅、培养皿等。
供试碳源:葡萄糖Glucose、果糖Fructose、蔗糖Sucrose、乳糖lactose、麦芽糖maltose;
供试氮源:硝酸钙(Ca(NO3)2)、硝酸铵(NH4NO3)、氯化铵(NH4CL)、尿素(CON2H4)、硝酸钾(KNO3)以上均为化学分析纯试剂,均由实验室提供。
0.1%NaOH溶液、0.1%HCl溶液、 75%酒精等。
1.2试验方法:
在无菌条件下将八角金盘黑斑病病菌接种在经高温无菌操作的马铃薯半组合培养基为基础培养基(马铃薯200克、琼脂20克、葡萄糖20克、蒸馏水1000毫升)培养基皿中,恒温25℃暗培养,取纯化良好的菌丝及孢子待用。
不同碳源与氮源对菌丝生长的影响研究[2-6]
碳源:分别以含碳量相等的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖和蔗糖做基础成分取代培养基中的葡萄糖的成分来配制培养基并分别标记好,每种处理4次重复。用无菌打孔器打取6mm直径的菌饼接种后置于25℃恒温箱内暗培养,每24h观察一次,利用十字交叉法定期测量菌落直径并记录。
氮源:分别以含氮量相等的硝酸铵、硝酸钙、氯化铵、尿素、硝酸钾添加到查氏培养基(磷酸氢二钾1.00g、硫酸镁0.50g、氯化钾0.50g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30.00 g、琼脂20.00g和蒸馏水1 L)为基础培养基的平板上培养基置换氮源并标记好,测量方法同上。
不同碳源与氮源对孢子生长的影响研究[7-10]
当菌种在培养基内长到一定时间可用显微镜观察,在产孢条件下对孢子萌发率的影响的试验;在预试条件下进行如下研究。
碳源:用含碳量相同的葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖、蔗糖为溶液并调匀作为碳源的孢子悬浮液,将等量孢子悬浮液放入其中,25℃恒温暗培养,按预试记录的孢子萌发的时间开始观察,并开始定时统计孢子萌发率,同时记录当有一处理接近或达到90%以上萌发时试验结束,共5组处理4次重复。
氮源:以葡萄糖为基础培养基,用含氮量相同的硝酸铵、硝酸钙、氯化铵、尿素、硝酸钾溶液并调匀作为氮源的孢子悬浮液,将等量孢子悬浮液放入其中, 25℃恒温暗培养,测量不同含源条件下孢子萌发率,共5个处理,重复4次测量方法同上。
不同温度对菌丝和孢子的影响研究。
以PDA培养基为基础材料,在无菌条件下,用已灭菌的直径为7mm的打孔器打入先前培养好的病菌菌种,并将直径7mm的菌丝片移入PDA培养基平板上中央处。然后分别培养于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的不同温度梯度里,培养3d后测量菌落形成的直径大小,共7个处理,每处理重复4次。配制以葡萄糖为溶液的孢子悬浮液,然后将适量的孢子悬浮液分装在灭完菌的培养皿中并盖上盖,分别放置在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃等不同温箱里,并在6种温度下进行孢子萌发试验。经12、24小时后,在显微镜下观察其孢子萌发率(每次观察时用胶头滴管将孢子悬浮液滴在载玻片上进行观察)。观察不同温度对孢子萌发的影响,共6个处理,3次重复。
不同光照对菌丝和孢子生长的影响。
在PDA培养基上接菌后分别置于3种不同光照条件下进行培养:⑴完全黑暗、⑵连续日光灯照射、⑶光暗交替:12h光照:12h暗处理,温度是25℃恒温,经4d后取出测量菌落直径,共3个处理,4次重复。
不同酸碱度对菌丝和孢子的影响。
经高压灭菌后的PDA培养基,用0.1%NaOH溶液、0.1%HCl溶液,在无菌条件下进行不同pH值调节,配制PH值分别为3、5、7、9、11、13培养基。用上述的方法接菌后,置于25℃温箱中培养,经4d后测量菌落直径,共6个处理,4次重复。
用0.1%NaOH溶液、0.1%HCl溶液、葡萄糖溶液调节PH值,配制PH值分别为3、5、7、9、11、13的孢子悬浮液,观察记录方法同上。